El primer panel de enfermedades transmitidas por vectores de Purdue detecta 22 patógenos diferentes en una sola prueba

viernes, 15 de julio de 2022



Un panel de diagnóstico desarrollado por investigadores de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Purdue permitirá a sus Laboratorio de Diagnóstico de Enfermedades Animales (ADDL) para detectar 22 patógenos transmitidos por vectores diferentes en una sola prueba. El panel, diseñado para ser utilizado en perros y gatos, es la única prueba de este tipo y pronto estará disponible para los clientes de la ADDL.

La Dra. Becky Wilkes, profesora asociada de diagnóstico molecular en el Departamento de Patobiología comparada, y jefe de las secciones de Molecular y Virología de la ADDL, desarrolló la metodología utilizando la secuenciación de próxima generación (NGS), un proceso que puede secuenciar grandes cantidades de ADN de manera más económica que otras técnicas. Disponible comercialmente por primera vez a mediados de la década de 2000, la tecnología NGS se ha utilizado para secuenciar el genoma humano y rastrear los brotes de origen alimentario y la transmisión de enfermedades infecciosas.

El enfoque novedoso del Dr. Wilkes de incorporar NGS como una herramienta de diagnóstico diario facilitará una identificación más precisa de una gama más amplia de patógenos en una sola prueba a través de la secuenciación rápida del ADN de los patógenos. La prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el estándar actual de la industria, solo puede detectar tres o cuatro patógenos a la vez en una sola prueba y solo da una señal fluorescente de que se detectan patógenos; no puede secuenciar su ADN.

“Estamos usando un método NGS específico para identificar específicamente los patógenos transmitidos por vectores, como los que se transmiten a través de la picadura de un mosquito, una pulga o una garrapata”, dijo el Dr. Wilkes. “Se pueden encontrar múltiples patógenos dentro de la misma garrapata y, a veces, las coinfecciones no se diagnostican porque no estamos buscando todos los organismos que podrían estar allí”.

El diagnóstico de enfermedades transmitidas por vectores en perros puede ser difícil porque hay muchos agentes causantes de enfermedades diferentes que pueden transmitirse a partir de una picadura de insecto y los signos clínicos causados ​​por estos agentes a menudo se superponen. Los pacientes también pueden presentar inicialmente signos no específicos, como fiebre y letargo.

Para el panel de NGS, el Dr. Wilkes desarrolló cebadores específicos (fragmentos cortos de ADN monocatenario) para cada organismo de interés, asegurando que los cebadores fueran específicos para cada patógeno. Luego colaboró ​​con Thermo Fisher Scientific para finalizar el diseño del ensayo, asegurando que los cebadores no interactuarían entre sí ni amplificarían el material genético del perro o el gato.

Los cebadores se dirigen a segmentos de ADN específicos en los patógenos de interés. Esto da como resultado la amplificación de estas secuencias específicas de patógenos si están presentes en la muestra. Cuando los patógenos están presentes, constituyen menos del 1% de la muestra. La mayor parte de la muestra está compuesta por material genético del huésped. NGS proporciona secuencias para todo en la muestra, incluidos los patógenos y los materiales genéticos del huésped. El enfoque NGS dirigido mejora las secuencias de los patógenos de interés para que sean más fáciles de detectar. Una vez que se secuencia el ADN objetivo, se puede comparar con la información en la base de datos GenBank, una colección anotada de todas las secuencias de ADN disponibles públicamente, para confirmar su identificación como patógeno.

“Mientras investigaba NGS, me sorprendió la cantidad de datos que genera”, dijo el Dr. Wilkes. “En el pasado, solo se podía secuenciar una pieza de ADN a la vez, que podía tener 1000 pares de bases. Ese es el proceso utilizado originalmente para secuenciar el genoma humano. Tomó 13 años y $ 3 mil millones. Con NGS, puede generar la misma información en cuestión de días. Su uso como herramienta de diagnóstico para la detección de patógenos no se probó cuando comencé a trabajar con NGS dirigidos. Eso me motivó a realizar esta investigación para ver si NGS podría usarse para crear un panel de diagnóstico específico que sería asequible para la comunidad veterinaria”.

En un caso reciente de necropsia canina en el Purdue Small Animal Hospital, el Dr. Viju Pillai, residente de patología anatómica, sospechó que el perro había sido infectado con la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, una enfermedad zoonótica transmitida por garrapatas relativamente rara causada por la bacteria Rickettsia ricketsii. El ADDL no tiene una PCR independiente para ese organismo y anteriormente no habría podido realizar una prueba en el sitio. Se habría enviado una muestra para la prueba de PCR en otro laboratorio.

El panel de NGS desarrollado por el Dr. Wilkes confirmó la sospecha del Dr. Pillai de que el caso era fiebre maculosa de las Montañas Rocosas. A medida que el panel se utilice más ampliamente, el diagnóstico más rápido de enfermedades menos comunes ayudará a los veterinarios a desarrollar planes de tratamiento adecuados para sus pacientes.

“La mayoría de las enfermedades transmitidas por garrapatas son bacterianas y se pueden tratar con doxiciclina”, dijo el Dr. Wilkes. “Pero hay algunas enfermedades transmitidas por vectores que son causadas por parásitos, y en esos casos la doxiciclina no funcionaría. Estos organismos se analizan con menos frecuencia y, si se pasan por alto, pueden retrasar el tratamiento adecuado”.

El diagnóstico y el tratamiento tempranos son especialmente críticos cuando el animal está infectado con una enfermedad zoonótica, una que puede propagarse a los humanos, como el virus del Nilo Occidental, la enfermedad de Lyme, la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas o la malaria. Aunque el panel inicial se enfoca en patógenos transmitidos por vectores en gatos y perros, la tecnología NGS se puede aplicar a paneles para una variedad de enfermedades que afectan a una variedad de especies.

“El método que estamos lanzando va a cambiar la forma en que hacemos diagnósticos”, dijo la Dra. Kenitra Hendrix, directora de ADDL y profesora asociada clínica de microbiología de diagnóstico veterinario. “Ya no estaremos limitados a seleccionar y elegir algunos patógenos para determinar si están presentes o no en la muestra. Podremos seleccionar estos paneles en función del síndrome que tenga el animal, lo que nos dará una mejor comprensión de todas las posibles causas de la enfermedad”.

El año pasado, la ADDL realizó 107.332 pruebas. La implementación de la plataforma de pruebas NGS, que requiere equipos de última generación y experiencia de laboratorio específica, ampliará la capacidad de ADDL para cumplir con su misión de brindar servicios de diagnóstico animal precisos y confiables y consultas a sus clientes, que incluyen veterinarios, funcionarios de salud, ganaderos y propietarios de animales. Se podrían desarrollar paneles futuros para enfermedades que se propagan a través del ganado, como cerdos y aves de corral.

“La validación de los paneles es un proceso largo y costoso”, dijo el Dr. Hendrix. “Por lo tanto, debemos ser estratégicos a la hora de implementar las pruebas que serán más útiles para nuestros clientes, pero las oportunidades son ilimitadas. El Dr. Wilkes es un destacado experto en diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas en animales. Somos muy afortunados de tenerla aquí en Purdue desarrollando estos paneles de diagnóstico”.

La investigación fue financiada por la Fundación de Salud Canina del American Kennel Club (AKC), que le otorgó al Dr. Wilkes una subvención de $103,000 para desarrollar el panel integral de NGS dirigido por vectores. El Dr. Jobin Kattoor, asociado de investigación posdoctoral en el Departamento de Patobiología Comparada, ayudó al Dr. Wilkes a validar el panel transmitido por vectores. A través de la secuenciación paralela, el panel incorporará pruebas para enfermedades infecciosas adicionales que pueden causar signos gastrointestinales, respiratorios, reproductivos, dermatológicos o neurológicos en perros y gatos.

Recientemente se invitó a la Dra. Wilkes a presentar su investigación en una reunión de la Flat-Coated Retriever Society of America, cuyos miembros quedaron asombrados por la cantidad de organismos que se pueden detectar con una sola prueba.

“Las pruebas transmitidas por vectores son solo una parte de este panel”, dijo el Dr. Wilkes. “El panel está validado para 22 patógenos transmitidos por vectores, pero contiene muchos más. Es capaz de detectar básicamente todos los patógenos conocidos en perros y gatos. En eso estamos trabajando”.

Escritor(es):
kat braz | pvmnews@purdue.edu

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